世界首例无猪内源性反转录病毒(PERV)传染性的

近交系小型猪新品系


       在 2017 年 6 月 23 日第八届北京实验动物科学国际论坛上,军事医学科学院章金刚研究员向大会做了题为“五指山近交系内源性反转录病毒(PERV)及无 PERV 传染性新种群建立研究”的报告,宣布我国科学家在世界上首次通过遗传选育的方式获得无 PERV 传染性的近交系小型猪。

       猪是异种器官移植的最佳供体。而用于人的猪源异种器官移植两大障碍之一,是猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus, PERV)的潜在感染风险。PERV 是一种以前病毒 DNA 形式整合入猪基因组中的反转录病毒,由 PERV-gag、pol、env 三基因组成,可随细胞基因组的复制而复制。部分猪源细胞可释放 PERV 病毒颗粒,并能感染多种体外培养的人源细胞。因此,消除 PERV 的潜在跨物种感染风险,是异种器官移植的必要安全考虑。

       解决 PERV 风险的途径有两种。一种是通过基因修饰技术去除猪体内 PERV 基因。代表成果是哈佛医学院遗传学教授乔治·丘奇和杨璐菡博士团队,利用新的基因编辑技术 CRISPR/Cas9,一次性的敲除了隐藏在猪基因组中的 62 个 PERV-pol 基因片段,体外实验验证病毒的感染率被削弱了近 1000 倍,结果发表在 2015 年 10 月《Science》杂志。同年,该团队联合创立了美国 eGenesis 生物技术公司,专注于将基于基因编辑的异种移植技术运用到临床医疗程序中。近日有报道称,eGenesis 公司经过多基因修饰的 PERV 阴性猪即将出生。与此同时,我国多家科研团队也在尝试采用基因编辑方法培育 PERV 阴性猪,并先后取得各种阶段性进展。

       排除 PERV 病毒潜在感染风险的另一种途径,则是选育无 PERV 感染风险的猪。军事医学科学院的章金刚研究员、马玉媛副研究员联合盖兰德生物科技首席科学家冯书堂教授,另辟蹊径,在世界上首次采用遗传筛选的方法,经过细胞共培养,采用 PCR、RT-PCR、反转录酶活性检测等方法进行鉴定,通过初筛与确证实验,参照美国 FDA 的标准,在五指山小型猪近交系中筛选出无 PERV 传染性的近交系小型猪个体。经初步遗传分析,所有筛选出的无 PERV 传染性个体之间存在一定的遗传规律。在这一重大发现基础上,研究人员正在对筛选出的无 PERV 传染性个体进行全基因组重测序分析,现已证实其中 1 个个体为 PERV-pol 基因缺陷型。至此,研究团队不仅第一次在国际上筛选出了无 PERV 病毒传染性近交系猪,而且从基因水平上验证了 PERV 病毒无传染性的原理。上述研究成果已申请国家发明专利两项,并即将在国际期刊杂志上发表论文。

       研究团队认为,无 PERV 传染性的小型猪近交系的选育成功,主要原因是五指山小型猪近交系经过长达 28 年的近交培育,已普遍具有 PERV 病毒 A、B 型弱、拷贝数少、无 C 型病毒的遗传特征,近交种群出现病毒感染性发生变异的个体。盖兰德生物科技有限公司正利用筛选出的无 PERV 传染性近交系猪群体培育新品系,父母均为无 PERV 传染性近交系猪的 F1 已于 2017 年 5 月底出生,研究团队将持续对其进行无 PERV 传染性的监测,未来有望进一步揭示 PERV 病毒 pol 基因缺陷型猪的遗传原理。相比较基因修饰的方法,近交系筛选的无病毒传染性猪,具有更可靠的病毒安全性,避免多种基因修饰对猪健康生长的潜在威胁,且可以大规模繁育,为批量生产安全标准的猪器官、组织与材料提供了保障
五指山小型猪近交系

    实验动物是生命科学研究和生物医药研发不可或缺的基础条件之一。生物医药科研及开发项目投资的40%-60%涉及实验动物,目前应用最广的实验动物是近交系鼠类。大型实验动物中,小型猪在形态学、解剖学、生理学等方面比其他动物种类更接近人类,且因伦理、繁育、成本及操作等优势,在实验动物中获得越来越多的关注。然而与近交鼠类相比,一直缺乏近交系是影响大型实验动物应用价值的一大障碍。


    五指山猪原产于我国海南五指山区,曾是我国濒临灭绝的小型猪种。原中国农业科学院畜牧研究所研究员、现北京盖兰德生物科技有限公司首席科学家冯书堂先生,以1公1母五指山猪为系祖,历经近30年的不懈努力,采用“仔配母”、“全同胞”交配等综合技术措施,不断创新大动物近亲繁育技术,解决了近亲繁殖所导致其后代高畸形率、高弱仔率和成活率恢复三个阶段的难题,育成F20至F24代小型猪近交系,F24近交系数已高达0.994,建立了完整的近交系谱与亚系,开发了系统的鉴定技术与专利,完善了小型猪近交系的繁育技术流程与规范,并研发出SPF级小型猪近交系技术与设施。经异体皮肤移植、全基因组测序等多方鉴定,其基因纯合率已达到近交系鼠类同等水平,验证了该小型猪近交系培育成功,填补了世界大动物近交系的空白,并被行业领域专家鉴定为一种新的种质资源(待命名)。目前,小型猪近交系已经进入产业化开发及应用阶段。

五指山小型猪近交系

作为新物种的五指山小型猪近交系:实验动物与异种移植的新境界
    五指山小型猪近交系具有体型小、性成熟早、繁殖率较高、不含应激反应基因、内源性逆转录病毒拷贝少、免疫代谢、心血管疾病等基因与人类有较高同源性等特点。该近交系经历20代以上近亲繁育,基因型高度纯合,少数基因在近交系群体中杂合度为一,其毛色、体型等遗传表型稳定,解剖生理等生物性状均一,个体差异极小,便于饲养管理,适于规模化、标准化生产。经与70余家科研与医疗机构合作研究证明,五指山小型猪近交系作为实验动物具有灵敏度高、可靠性强和可重复性好等特点,符合生物医药研究与开发的各类要求,可节约大量的人力、物力及财力。同时,小型猪近交系具有便于基因修饰和改造的优势,是异种组织与器官移植研究与产品开发的最佳载体。综合在生命科学及其其他领域的潜在价值,小型猪近交系有望成为生物医药产业的新型支柱性资源。
五指山小型猪近交系的科学性、先进性和唯一性
     1.参照并改进近交系鼠类经典的异体皮肤移植鉴定方法,由中国人民解放军总医院(301医院)全军创伤烧伤重点实验室设计并完成“五指山小型猪近交系异体皮肤移植鉴定试验,2013年发表成果显示该近交系猪个体间未发现免疫排异反应,证明其个体间免疫细胞具有同种抗原、基因高度纯合,从而确证该近交系育成。该研究同时创建了小型猪近交系的鉴定方法和标准,也为大型哺乳动物近交系提供了系统的鉴定方法和标准。
      2.  五指山小型猪近交系的全基因组序列分析与鉴定于2012年由华大基因完成,该项研究发现全基因组2.5GB,共注释出20,326个基因,其中有18,000个基因和人等近源物种有同源关系,与人类的平均蛋白相似度达到85%以上;该近交系全基因组纯合度高达60%,近似近交系小鼠(非近交系动物仅达到8-11%),进一步证明该近交系研发成功。该研究还发现近交系小型猪的内源性逆转录病毒(PERV)A、B型拷贝数较少,且不存在C型拷贝(军科院、华大基因组提供)。与人类心血管疾病相关基因对比,小型猪近交系仅缺少了ARMS2和CETP,其余245个基因和人的相似度约为85%。已发现人类1624药物靶基因中,该近交系有1618个与人类同源(鼠、猕猴只有1616个)。此结果从基因水平上验证了五指山小型猪近交系是理想的实验动物模型,具有作为人类“替难者”的完整功能和广泛价值。
      3.  利用Illumina公司研发的猪高密度SNP芯片(6万个SNPs),对该近交家系中的F17至F226个世代共96个样品的基因型进行了系统测定,并与非近交系五指山猪进行比对分析。发现分布于近交系 18对常染色体上的50,418个有效SNPs中,F20 SNPs已被固定的比例高达80.0%以上, 而非近交系五指山猪的所有染色体区域均表现高度杂合,50,418个有效SNPs弥漫性、均匀性、无规律的分布18个染色体。6个世代96个样本X染色体基因组的1095个SNPs位点中,虽有182个位点具有一定的多态性,但基因组纯合区高达83.4%,而16个海南五指山猪样本几乎无一纯合,这一结果说明两者遗传基础已经完全不同。48 头WZSP近交系(F20-F22)个体7号染色体上与MHC 免疫相关的13个基因中,F22个体全部纯合,F20和F21仅有一个基因杂合,而对照组无一纯合,该结果不但为其异体皮肤移植不发生免疫排斥反应提供了依据,而且在分子遗传学的层面上,再次证明一种新的遗传资源诞生。